• <xmp id="vhw13"></xmp>
      1. <bdo id="vhw13"></bdo>
        <track id="vhw13"></track>

        <menuitem id="vhw13"><strong id="vhw13"></strong></menuitem><tbody id="vhw13"><div id="vhw13"><address id="vhw13"></address></div></tbody>

        <menuitem id="vhw13"></menuitem>
      2. <track id="vhw13"></track>
      3. <track id="vhw13"><div id="vhw13"></div></track>

        熱門標簽:寫本科論文 寫作發表 工程師論文 寫一篇論文多少錢

        當前位置: 論文多少錢 > 醫學論文 > 解脲脲原體的三種檢測技術比較研究

        解脲脲原體的三種檢測技術比較研究

        時間:2021-08-26作者:陶琪 李桂軍
        本文導讀:這是一篇關于解脲脲原體的三種檢測技術比較研究的文章,RNA恒溫擴增實時熒光方法(Simultaneous amplification and testing,SAT)作為一種新的檢測技術,檢測Uu結果陽性提示活菌現癥感染,能更好地指導臨床診治Uu感染,逐漸被用于臨床。

          摘    要: 目的:對比分析尿素-精氨酸肉湯顯色法、實時熒光定量PCR方法(FQ-PCR)及RNA恒溫擴增實時熒光方法(SAT)檢測解脲脲原體(Uu)結果的一致性和最低檢測下限。方法:采集300例疑似Uu感染患者的生殖道分泌物標本。標本同時用尿素-精氨酸肉湯顯色法、FQ-PCR方法及SAT方法檢測Uu。采用Kappa檢驗分析三種方法檢測結果的一致性。陽性樣本經1:20連續稀釋,三種方法檢測并分析最低檢測下限。評估9種細菌污染對尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測Uu結果干擾。結果:尿素-精氨酸肉湯顯色法、FQ-PCR方法和SAT方法 Uu陽性檢出率分別為19.33%、30.67%和33.00%。SAT方法與尿素-精氨酸肉湯顯色法、SAT方法與FQ-PCR方法和FQ-PCR法與尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測結果的總一致率分別為76.33%、85.67%和82.00%,檢測結果的一致性分別為較弱(kappa值為0.40)、高度一致(kappa值為0.67)和中度一致(kappa值為0.53)。三種方法中SAT方法檢測下限最低,敏感性最高。大腸埃希菌和肺炎克雷伯氏菌污染可引起尿素-精氨酸肉湯培養判斷Uu的假陽性。結論:三種方法中SAT方法檢測Uu的敏感性最高,其與FQ-PCR方法檢測結果高度一致,陽性結果提示現癥感染,臨床應用價值更高。

          關鍵詞 :     恒溫擴增技術;熒光定量PCR:肉湯培養;解脲脲原體;

          Abstract: [Objective]To analyze 3 laboratory methods for detection of Uu by analyzing their consistencyandminimum detection threshold.[Method]300 discharge samples were collected and detectedby using urea-arginine broth culture Fluorescent quantitation PCR( FQ-PCR) and Simultaneous amplification and testing( SAT). Consistency of detection results and minimum detection threshold of three methods described above were analyzed by Kappa test and 1: 20 multiple dilution. The effect of 9 bacterial contamination on Uu result using urea-arginine broth culturewasevaluated. [Result]With urea-arginine broth color method,FQ-PCR method and SAT method,thepositive rates of Uu were19. 33%,30. 67% and 33. 00%,respectively. The consistence rate among SAT and urea-arginine broth culture,SAT and FQ-PCR,FQ-PCR and urea-arginine broth culturewere76. 33%,85. 67% and 82. 00%,respectively,which showed weak consistency( Kappa = 0. 40),highly consistency( Kappa =0. 67) andmoderately consistency( Kappa =0. 53).Among three methods,SAT showed the highest sensitivity due to minimum detection threshold. The contamination of E. coli and K. pneumonia could cause the false positive of Uu detected by using urea-arginine broth culture.[Conclusion]Among three methods,SAT showed the highestsensitivity and highly consistencewith FQ-PCR. Positive results suggested a symptomatic infection. SAT has higher clinical value than urea-arginine broth culture and FQ-PCR.

          Keyword: simultaneous amplification and testing; Fluorescent quantitation PCR; broth cultivation; ureaplasmaurealyticum;

          解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum,Uu)的持續感染可引起不孕不育、早產、尿道炎等多種疾病。實時熒光定量PCR方法(FQ-PCR)和尿素-精氨酸肉湯顯色法是臨床實驗室檢測Uu的常用方法。RNA恒溫擴增實時熒光方法(Simultaneous amplification and testing,SAT)作為一種新的檢測技術,檢測Uu結果陽性提示活菌現癥感染,能更好地指導臨床診治Uu感染,逐漸被用于臨床[1]。尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測Uu會出現假陽性[2],FQ-PCR檢測Uu-DNA結果陽性無法判斷現癥感染還是既往感染[3]。我們近期臨床應用發現,SAT檢測Uu較之FQ-PCR方法和肉湯顯色法的靈敏度相對較高,F將結果報告如下。
         

        解脲脲原體的三種檢測技術比較研究
         

          1、 材料與方法

          1.1、 材料

          1.1.1 、標本來源

          選擇2020年4-10月間來嘉興市婦幼保健院生殖中心就診,疑似Uu感染不孕不育癥患者300例。對采集的患者生殖道標本同時用尿素-精氨酸肉湯顯色法、FQ-PCR方法及SAT方法檢測Uu。

          1.1.2 、主要儀器與試劑

          ABI 7500熒光定量PCR分析儀(美國,ABI公司)。Uu-DNA檢測試劑購自中山大學達安基因股份有限公司,Uu-RNA檢測試劑購自上海仁度生物科技有限公司,Uu培養鑒定試劑盒購于法國梅里埃公司。其它試劑實驗室自備。

          1.2 、方法

          1.2.1、 尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測Uu

          標本接種尿素-精氨酸肉湯培養基并置37℃培養48h,觀察肉湯顏色變化,由黃色變成紅色或粉紅色判斷Uu檢測陽性。

          1.2.2 、FQ-PCR方法檢測Uu

          標本經12000rpm離心10 min棄上清,沉淀經1mL生理鹽水洗滌,再次離心棄上清,沉淀加50μL DNA裂解液混勻,100℃水浴10min,置4℃靜置30 min,12000rpm離心2 min。取上清液2μL加入配好的20μL PCR反應體系中,離心并置PCR儀進行擴增。擴增條件為93℃2 min預變性;93℃45s,55℃60s,10個循環;93℃30s,55℃45s,30個循環。分析擴增曲線呈“S”型且CT值<30判斷Uu-DNA陽性。

          1.2.3、 SAT方法檢測Uu

          取200μL標本與等體積保存液混勻后,加100μL核酸提取液振蕩,60℃加熱5min并置室溫10min,置磁珠架靜置5min,棄液體保留磁珠,加洗滌液1000μL與磁珠混勻后,再次置磁珠架5min,吸液體保留磁珠。重復洗滌二次后,棄液體。加40μL配好的SAT-PCR反應體系與處理好的磁珠混勻,取30μL置PCR反應管中,放置干式恒溫儀上運行60℃10min,42℃5min后,加42℃預熱的酶10μL并置PCR儀中42℃1min,擴增40個循環。分析擴增曲線呈“S”型判斷Uu-RNA陽性。

          1.3 、統計學處理

          采用SPSS 17.0軟件進行數據處理。采用行×列表資料的χ2檢驗進行陽性檢出率的比較。利用kappa檢驗評價三種檢測方法結果的一致性,kappa值大于0.8為一致性極強,0.6~0.8為高度一致,0.4~0.6為中度一致,0.2~0.4為一致性較弱[1]。P<0.05為差異有統計學意義。

          2、 結果

          2.1、 Uu感染陽性檢出率

          300例疑似Uu感染患者經尿素-精氨酸肉湯顯色法、FQ-PCR方法和SAT方法的檢出陽性例數分別為58例、92例和99例,陽性檢出率分別為19.33%、30.67%和33.00%。檢出率差異顯著(χ2=16.024,P<0.001)。

          2.2、 SAT方法與尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測結果一致性比較

          對300例疑似Uu感染患者生殖道標本同時應用SAT方法和尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測Uu,結果見表1。從表1可見,陽性檢出率SAT法高于尿素-精氨酸肉湯顯色法(P<0.05),且兩種方法檢測結果的kappa一致性檢驗值僅為0.40,一致性較弱,陽性一致率僅為43.43%,總一致率為76.33%。此外發現有4份尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測陽性且培養基呈渾濁狀的標本經SAT及FQ-PCR方法檢測均為陰性,進一步細菌培養發現尿素-精氨酸肉湯中大腸埃希菌生長。說明尿素-精氨酸肉湯中混有細菌生長會引起假陽性結果。

          表1 SAT方法與尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測Uu結果比較
        表1 SAT方法與尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測Uu結果比較

          *:McNema配對卡方檢驗

          2.3 、SAT方法與FQ-PCR方法檢測結果一致性比較

          對300例疑似Uu感染患者生殖道標本同時應用SAT方法和FQ-PCR方法檢測Uu,結果見表2。從表2可見,SAT法與FQ-PCR法陽性檢出率無差異(P>0.05),且兩種方法檢測結果的kappa一致性檢驗值為0.67,檢測Uu結果高度一致,陽性一致率達到74.75%,總一致率85.67%。

          表2 SAT方法與FQ-PCR方法檢測Uu結果比較
        表2 SAT方法與FQ-PCR方法檢測Uu結果比較

          *:McNema配對卡方檢驗

          2.4 、FQ-PCR方法與尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測結果一致性比較

          對300例疑似Uu感染患者生殖道標本同時應用FQ-PCR方法和尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測Uu,結果見表3。從表3可見,FQ-PCR法陽性檢出率高于尿素-精氨酸肉湯顯色法(P<0.05),且兩種方法檢測結果的kappa一致性檢驗值僅為0.53,檢測Uu結果中度一致,陽性一致率為52.17%,總一致率82.00%。

          表3 尿素-精氨酸肉湯顯色法與FQ-PCR方法檢測Uu結果比較
        表3 尿素-精氨酸肉湯顯色法與FQ-PCR方法檢測Uu結果比較

          *:McNema配對卡方檢驗

          2.5 、三種方法檢測Uu的最低檢測下限比較

          將經三種方法檢測均為陽性的標本用尿素-精氨酸肉湯培養基按1:20,1:400,1:8000……連續20倍稀釋,混勻并吸取各稀釋濃度標本200μL分別至尿素-精氨酸肉湯中35℃培養48h,觀察各瓶肉湯培養基顏色變化并判斷陰陽性后,每瓶取0.5mL分別利用FQ-PCR和SAT法檢測Uu。結果發現三種方法中尿素-精氨酸肉湯法最低檢測下限最高,稀釋到1:206時檢測即為陰性,而FQ-PCR方法SAT方法直到分別稀釋到1:208和1:2010時檢測才為陰性。三種方法中SAT方法的檢測下限最低,敏感性也最高。即使FQ-PCR方法的敏感性也比尿素-精氨酸肉湯法高400倍,這提示我們,對經尿素-精氨酸肉湯檢測結果可疑標本應利用SAT或FQ-PCR方法復檢Uu,以免出現假陰性結果。結果見表4。

          表4 不同稀釋度Uu陽性標本經尿素-精氨酸肉湯、SAT和FQ-PCR方法檢測結果
        表4 不同稀釋度Uu陽性標本經尿素-精氨酸肉湯、SAT和FQ-PCR方法檢測結果

          2.6、 細菌污染對尿素-精氨酸肉湯培養法檢測Uu結果干擾

          取金黃色葡萄球菌(ATCC25923、ATCC29213)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希氏菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC700603)和糞腸球菌(ATCC29212)和臨床分離的白色假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌共9種細菌。調各菌液濃度1.0麥氏比濁,取200μL至尿素-精氨酸肉湯培養基中35℃培養48h,觀察肉湯培養基顏色變化并判斷陰陽性后,取500μL離心集菌,利用SAT、FQ-PCR法進行Uu檢測。結果發現大腸埃希菌和肺炎克雷伯氏菌污染可引起尿素-精氨酸肉湯培養判斷Uu的假陽性。故對于尿素-精氨酸肉湯培養基呈粉紅色或紅色且肉湯渾濁的Uu檢測結果,應利用SAT或FQ-PCR方法復檢Uu,以免出現假陽性結果。

          3、 討論

          Uu的臨床診斷依據為患者有泌尿生殖道感染相關癥狀,同時實驗室檢測Uu陽性可診斷Uu感染[2]。尿素-精氨酸肉湯顯色法是實驗室檢測Uu最常用方法,但此方法敏感性不強[4]。如本組資料300例疑似Uu感染患者生殖道標本經尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測陽性率僅為19.33%,明顯低于FQ-PCR方法和SAT方法的陽性檢出率。此外將Uu陽性標本按1:20,1:400,1:8000……連續20倍稀釋,稀釋到1:206以后尿素-精氨酸肉湯顯色法檢測結果開始為陰性,而FQ-PCR方法SAT方法直到分別稀釋到1:208和1:2010以后時檢測結果才為陰性。結果說明三種方法中尿素-精氨酸肉湯法最低檢測下限最高,敏感性最低,檢測結果存在一定假陰性。故對經尿素-精氨酸肉湯檢測結果可疑標本應利用SAT方法或FQ-PCR方法復檢Uu,以免出現假陰性結果。尿素-精氨酸肉湯顯色法也存在一定的假陽性[2]。如本組資料將大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌接種到尿素-精氨酸肉湯培養基35℃培養48h,Uu檢測結果呈陽性。這說明培養基中混有分解尿素或精氨酸的雜菌生長會引起假陽性結果,但此類情況尿素-精氨酸肉湯均呈渾濁狀。對于尿素-精氨酸肉湯培養基呈粉紅色或紅色且渾濁的情況可利用SAT方法或FQ-PCR方法復檢Uu,避免出現假陽性結果。

          利用FQ-PCR方法檢測Uu-DNA也是實驗室常用方法之一,此方法檢測靈敏度較高。如本組資料FQ-PCR方法的最低檢測下限比尿素-精氨酸肉湯法低400倍。但因病原體死亡后,其DNA完全降解需要一段時間,故檢測Uu-DNA陽性只能說明患者近期發生了Uu感染,而無法判斷檢測的DNA是來自體內死亡Uu病原體未完全降解DNA還是活Uu病原體DNA,也就不能正確判斷是現癥感染還是既往感染,從而對指導臨床Uu治療及療效觀察作用有限。而SAT方法檢測的是病原體RNA[2,5]。RNA僅存在于活病原體體內,病原體死亡RNA自動降解,故SAT方法檢測Uu陽性可判斷為現癥感染。本組資料中18例FQ-PCR方法檢測陽性而SAT方法檢測陰性結果可能就是上述情況。

          本組資料通過對比SAT方法與FQ-PCR方法檢測Uu結果的一致性時,雖然發現兩種方法的kappa一致性檢驗值為0.67,檢測結果高度一致,與文獻報道結論一致[1],但其檢測下限比FQ-PCR方法低400倍,此外有25例FQ-PCR方法檢測陰性而SAT方法檢測陽性,均說明SAT檢測靈敏度比FQ-PCR高?傊,SAT方法敏感性強,結果陽性可提示現癥感染,用此方法動態檢測,能更好地指導臨床Uu診治。

          參考文獻

          [1]方偉禎,蔡振華,張銀霞,等.SAT技術在沙眼衣原體和解脲脲原體檢測中的應用[J]中華檢驗醫學雜志, 2018,41(5)-380-384.
          [2]張岱,劉朝暉生殖道支原體感染診治專家共識[J]中國性科學, 2016,25(3):80-82.
          [3]童郁,邵展,戴顯寧,等.RNA恒溫擴增技術診斷新生兒解脲脲原體感染的價值[J]中華新生科雜志, 2017,32(5):371-373.
          [4]張欠欠,許恒立,原軍婷,等熒光定量PCR檢測淋球菌、沙眼衣原體和解脲脲原體結果分析[J] .中國人獸共患病雜志, 2016,32(3):312-314.
          [5]Chen Q Zheng H,Zhang QH et al.Development and evaluation of a real-time method of simultaneousamplification and testing of enterovirus 71 incorporating aRNAinternal cont
          rol system[J].Journal of Virological Mehtods ,2014, 196(1):139-144.

        關聯標簽:
        相關文章
        聯系我們
        • 寫作QQ:3008635931
        • 發表QQ:3008635930
        • 服務電話:13701839868
        • 售后電話:18930493766
        • 郵箱:shlunwen@163.com
        網站地圖 | 網站介紹 | 聯系我們 | 服務承諾| 服務報價| 論文要求 | 期刊發表 | 服務流程

        將微信二維碼保存到相冊

        打開微信掃一掃從相冊識別

        1.點擊下面按鈕復制QQ號

        3008546108

        2.打開QQ→添加好友/群

        粘貼QQ號,加我為好友

        男女肉粗暴进来120秒动态图